Life-cell sensor for G1/S transition DHB-Ven

构建：

The sensor includes amino acids 994–1087 of human DNA helicase B fused to the yellow fluorescent protein mVenus (DHB-Ven), and contains four CDK consensus phosphorylation sites, a nuclear localization signal, and a nuclear export signal.

DHB是DNA解旋酶B的片段，该片段上包含CDK的磷酸化位点、NLS、NES，在Addgene上可以找到这个质粒的序列；该质粒使用CSII-EF慢病毒载体，构建MCF10A稳定表达细胞系，流式筛选；

原理：

体外磷酸化实验可知，DHB的该区域主要被CDK2/cyclin A磷酸化，也会被CDK2/cyclin E较弱地磷酸化，而不被CDK1/cyclin B，CDK4/cyclin D，CDK6/cyclin D所影响；添加Cdk1/2抑制剂，可以改变DHB的细胞质定位，使其回到核中，该过程只需要大概7分钟，而对于G1期本就是核定位的细胞影响不大；

使用CDK4/6、EGFR、MEK、p38、Akt、PI3K抑制剂以及Cdk1的特异性抑制剂均没有效果，说明DHB的定位主要受到Cdk2的影响，且在核外具有本底的去磷酸化活性；现已知，磷酸化后的DHB具有出核能力，若在核外被去磷酸化则会回到细胞核中，新生细胞（G1）为核定位，后随生长逐步转移到胞质，在G2/M时变为细胞质定位，Cdk2的活性亦伴随着这个过程逐步增大；

该Sensor使用胞质/核质的荧光信号比作为CDK活性的评估标准；为了便于测量细胞质的荧光信号，作者在核周围选择了环形区域作为细胞质统计范围；

该Sensor统计得到的信号有如下几种pattern：

G1/S的准入通路：

Mitogen促进cyclinD上调后结合Cdk4/6，结合后可以磷酸化Rb，释放E2F的结合，上调cyclinE，cyclinA、Cdk2以及其他一些S期基因