RNA-seq数据分析中的MA图和方差膨胀
卢旺MA图
- MA图在RNA-seq中用于数据质量控制和整体分布观察，其每个点代表一个基因，
- X轴：$A = \frac12 (log_2(Group1) + log_2(Group2))$，代表基因在两组样本中的平均表达水平
- Y轴：$M = \log_2(Group1) - log_2(Group2)$，这就是$log_2 FoldChange$
- 在MA图中，绝大多数基因应该围绕在y=0（FoldChange=1，x轴）的水平线附近，表示没有差异，只有差异表达基因会偏离Y=0线，向上或向下分散
- MA图主要用于观察FoldChange的分布是否依赖于基因本身的表达水平，该问题也称为
方差膨胀
方差膨胀问题
- 方差膨胀指的是在统计模型中，某个或某类观测值的方差远大于模型所期望的方差，从而导致其波动范围被不合理地放大
- 在RNA-seq的MA图语境下，它特指
低表达基因的Log2 Fold Change方差异常增大 的现象 - 这并非生物学真实情况，而是由技术局限性导致的统计偏差，可以简单理解为固定分度值的尺子在测量小的数据时，会由于不的精确而显得波动巨大，因此可能本来很小的差异被测量工具放大了
- RNA-seq数据本质上是计数数据，通常服从泊松分布，其方差主要来源于抽样方差，在RNA-seq中，低表达基因通常会因为数量少而被更少地抽样到，但实际上，这个差异很可能是由于计数太低，随机抽样“运气”不好造成的，而不是真正的生物学差异
- 在一个理想的、无偏的数据集中，无论基因表达量是高是低（X轴的值），FoldChange的波动范围应该是均匀的（Y轴的离散度一致）
- 在存在方差膨胀的RNA-seq数据集中，MA图通常表现为
- 在右侧（高平均表达量区域），基因的Log2 FoldChange密集地分布在0线附近，波动范围很窄
- 在左侧（低平均表达量区域），基因的Log2 FoldChange像“喇叭”或“扇子”一样散开，波动范围非常宽。这就是方差膨胀的典型视觉特征
- 如果不处理方差膨胀，会
- 产生大量假阳性，许多低表达但并无真实生物学差异的基因，会因为其巨大的、随机的Log2FC而被错误地鉴定为“差异表达基因”
- 导致结果不可靠，使得最终差异基因列表中会混杂大量“噪音”，误导后续的生物學解释和验证实验
- 可以使用
DESeq2、edgeR等工具对方差膨胀问题进行矫正
Kallisto和Sleuth对方差膨胀问题的处理策略
传统的工具如DESeq2在得到基因或转录本的计数矩阵后，就将其视为确定的、固定的值。但Sleuth认为，由Kallisto等工具通过引导程序估计出的转录本丰度（TPM/Counts）本身是存在不确定性的。这种不确定性在低表达转录本中尤其显著。Sleuth的核心理念是：将这种量化不确定性直接整合到差异表达测试的统计模型中。其分析流程可以分为3步，
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获取方差的原始数据
当使用Kallisto进行转录本定量时，通过
-b参数（例如-b 100）运行引导程序，Kallisto会为每个样本生成：一个“最佳猜测”的丰度估计值，以及数十或数百个引导样本，这些样本模拟了由于测序读长随机抽样而导致的丰度估计波动。即是说，其不是只告诉你“这个转录本的平均表达量是10”，而是给了你100次独立测量的结果（如 9.5, 10.8, 11.2, 9.1, …），让你能直接计算出这个平均值为10的测量误差（方差） -
建立方差与均值的全局关系
随后，Sleuth会汇集所有样本、所有转录本的引导数据，拟合一个测量误差模型。这个模型描述了转录本丰度的方差如何随其平均表达水平变化。与计数数据类似，Sleuth可以观察到低丰度转录本的量化不确定性（方差）远高于高丰度转录本，这正是导致低表达基因方差膨胀的根本原因。这个模型使得Sleuth能够“知道”对于一个给定的平均表达水平，一个转录本的丰度估计值“通常”应该有多大的波动范围。
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方差收缩
这是Sleuth解决方差膨胀最核心的一步，它通过一个加性线性模型来实现。其首先需要构建完整模型，其包含了您关心的实验条件（例如
~ condition）。随后需要构建不包含实验条件的简化模型。最后使用套索算法执行收缩，对这两个模型进行比较，在这个过程中：- 对于每个转录本，它都会计算一个“原始”的效应大小（β值，类似于Log2FC）和其标准误。
- 然后，它利用第二步建立的全局测量误差模型作为先验，对每个转录本的效应大小和方差进行收缩。
收缩的逻辑是：
- 如果一个低表达转录本的β值很大，但其引导程序显示它的量化不确定性也很高（方差大），那么Sleuth会认为这个巨大的β值很可能是由测量噪音造成的。因此，它会强烈地将这个β值向零收缩，并增大其标准误，导致其最终不显著
- 如果一个高表达转录本的β值很大，且其量化不确定性很低（方差小），Sleuth会认为这个效应是可靠的，收缩幅度会很小
- 如果一个低表达转录本的β值很大，但它的量化不确定性异常地低（即尽管表达低，但多次引导估计都很稳定），Sleuth也会认为这个效应可能是真实的，从而给予较小的收缩